Einst war die Nicolaikirche eine Kapelle in der nördlichen Vorstadt der Lutherstadt Eisleben. Damals noch unter einem anderen Namen, wurde die Kapelle St. Godehard erstmals im Jahr 1191 erwähnt. Als friesische Siedler im 13. Jahrhundert nach Eisleben kamen, übertrugen sie der Kapelle den Namen ihres Heiligen St. Nikolaus als Nebenpatron.
Im 15. Jahrhundert wurde die Kirche umfassend umgebaut und als Pfarrkirche genutzt. 1426 wurde zunächst der Chor und später das Kirchenschiff neu erbaut, bevor – laut einer Inschrift – 1462 der Turmbau begann. Bis dahin stand die Kirche unter der doppelten Schutzherrschaft der Heiligen St. Godehard und St. Nikolaus. Es wird vermutet, dass die dreischiffige, spätgotische Hallenkirche erst mit ihrer Neuweihe zur St. Nicolaikirche umbenannt wurde.
Während der Reformationszeit gewann die St. Nicolaikirche an Bedeutung, da hier in den Jahren von 1525 bis 1536 der Reformator Johannes Agricola, der ein enger Vertrauter Martin Luthers war, predigte.
Zu DDR-Zeiten befand sich die Kirche in einem sehr schlechten Zustand. Erst ab 1990 erhielt die Kirche ein neues Dach, womit das Gebäude vorerst gesichert werden konnte. Seitdem fanden weitere Sanierungen an und in der Kirche statt. Eine umfassende Modernisierung der St. Nicolai erfolgte bis 2022.
Im Rahmen der kompletten Neugestaltung wurde hier ein Kolumbarium errichtet – das erste seiner Art in Sachsen-Anhalt. Die Grabanlage umfasst 52 Urnenschreine, die eine Art Totenstadt innerhalb der Kirche bilden. Jeder Urnenschrein trägt einen von mehreren unterschiedlichen spätgotischen Giebeln und verweist damit auf die Entstehungsepoche der St. Nicolai.
Ein weiterer Höhepunkt der Innensanierung sind die fünf großen Kirchenfenster im Chor, die von dem Glaskünstler Jakob Schreiter gestaltet wurde. Sie zeigen als Motiv das sanft im Wind wehende Grabtuch Christi.
In der St. Nicolaikirche befindet sich außerdem ein Archiv des Evangelischen Kirchenkreises Eisleben-Sömmerda, in dem Archivalien der Kirchengemeinden aus der Region aufbewahrt werden.
